Православный храм Святого Духа построен при князе Ольгерде около середины XIV века (1340). Неизвестно, каменной или деревянной была построенная церковь. При храме был основан женский монастырь, чаще считается, что его основательницей была вторая жена Ольгерда Иулиания (Ульяна), которая была в нём и похоронена.
Церковь упоминается в привилее Витебской земле польского короля и великого князя литовского Александра Ягеллончика 1503 года. В инвентаре 1618 года церковь названа в числе каменных. 30 октября 1632 года в «Пунктах успокоения граждан Короны и Великого княжества Литовского русского народа религии греческой» упоминалась пустая церковь Св. Духа «в поле» в Витебске. Но несмотря на требования православных церковь перешла к униатам.
В августе 1649 года войско украинского казацкого гетмана Богдана Хмельницкого разбило армию польского короля Яна Казимира под местечком Зборов в Украине. Итогом сражения стал договор Хмельницкого с польским королём, среди условий которого было предоставление свободы вероисповедания православным Великого княжества Литовского и Речи Посполитой, а также возвращение им забранных униатами церквей, среди которых «Богородицы в Витебске Благовещения Богоматери в нижней крепости и церковь за городом Св. Духа». Однако уже в 1652 году Ян Казимир подтвердил привилей, данный униатам Владиславом IV 14 марта 1635 года.
При взятии Витебска русскими войсками на период русско-польской войны 1654-1667 г.г. церковь Святого Духа становится православной (богослужения с 1661 г.). Каменной она изображена на чертеже Витебска 1664 года. Но по условиям Андрусовского перемирия 1667 года, город был возвращен Речи Посполитой.
В 1697 году при церкви основан униатский базилианский женский монастырь. В конце XVIII века (?) храм полностью перестроен в стиле позднего барокко на средства мещанина Потапа Бибки. Каменная церковь XVIII века изображена на рисунке Ю. Пешки начала XIX века.
В 1839 году, после присоединения униатов к православию, храм и монастырь преобразованы в православные. Монастырь упразднён в конце 1850 - начале 1860-х годов. К 1870 году храм был перестроен.
Церковь закрыта в 1923 году. Здание храма пострадало в Великую Отечественную войну. 15 мая 1948 года республиканская комиссия по охране памятников архитектуры постановила здание не восстанавливать и исключить из списков памятников республиканского значения. Окончательно разрушено в конце 1950-х - начале 1960-х (взорвана в 1962 г.).
Храм являлся сложным по композиции каменным строением, увенчанным пятью шатрами с головками на светловых барабанах. Бабинец церкви имел два яруса: на верхнем находились хоры, которые со стороны главного фасада освещались окнами: тремя высокими прямоугольными и одним круглым. Церковь, построенная на основе старого храма в XVIII веке, была трёхнефной шестистолпной базиликой с двумя многоярусными башнями на главном фасаде. Она была выполнена в стиле, близком к «виленскому барокко». Однако, от других храмов этого стилевого направления Духовскую церковь отличало наличие большого купола над центральным нефом. В подвалах храма были устроены двухъярусные погребальные камеры. Храм был ориентирован по оси запад-восток. После перестройки церкви в конце 1860-х годов она приобрела псевдорусские черты. Две фасадные башни были разобраны, вместо них построена шатровая колокольня, переделаны окна.
Памятная книжка Витебской губернии на 1865 год. Санкт-Петербург, 1865 г.