Пятиглавый собор с колокольней построен в 1659 году, на месте ветхой деревянной церкви, с приделом во имя святого Николая Чудотворца, на средства купца Силы Грудцына. (Правда, еще в 1658 году по завещанию других видных купцов города — семьи Босых — в монастырь на церковное строительство было пожертвовано 1500 руб.) Заложенный в 1659 году по заказу Силы Грудцына, собор возводили затем на средства его брата Ивана Грудцына. Однако через некоторое время в связи со смертью братьев работы были приостановлены. Старец этой обители Филарет, тесть третьего брата, Василия Грудцына, завещал ему достроить храм и даже оставил на это деньги. Однако Василий деньги присвоил, а сооружать собор не стал. Лишь после жалобы игумена монастыря Андроника в 1689—1690 годах патриарху Иоахиму он возобновил строительство, которое было закончено, согласно описи города, в 1690-х годах. Фасады Троицкого храма сходны с фасадами собора Михайло – Архангельского монастыря, но в Троицком соборе шире используются цветные изразцы. Кроме того колокольня Троицкого собора в отличии от Архангельского находится не сбоку, а по середине его западного фасада и через ее основание устроен вход в собор по лестнице, ведущей на паперть.
В 1925 году, после ликвидации коммуны, Троицкий собор был передан музею, ключи от собора переданы 23 марта 1926 года. Несмотря на это в сентябре 1926 года, без ведома музея, с колокольни Троицкого собора сняты колокола, сданы в комцветфонд и увезены из Устюга. На галереях собора разместились с одной стороны мастерская по изготовлению гробов, с другой – кинозал. В подклети собора овощехранилище и жилые комнаты. В 1933 году представители Академии наук заколотили двери собора. Главная достопримечательность Троицкого собора его пятиярусный иконостас XVIII века, один из лучших в русском декоративном искусстве. Этот иконостас по праву можно назвать детищем, настоятеля Троице–Гледенского монастыря игумена Геннадия (в миру – Германа). Назначен 24 сентября 1771 года, был настоятелем монастыря 23 года, умер 18 августа 1794 года, похоронен в Троице–Гледенском монастыре (в настоящее время могила уничтожена). Более подробно про игумена Геннадия можно прочитать О. Б. Зенкова «Троицкий игумен». 25 января 1776 года игумен Геннадий отправляет епископу Иоанну прошение о благословении строительства нового иконостаса в Троицком соборе. 30 января 1776 года разрешение получено. Сохранившийся договор монастыря с иконописцами и резчиками о постановке и украшении соборного иконостаса позволяет уточнить дату его возведения и имена мастеров.
Иконостас сооружался с 1776 по 1784 год резчиками из Тотьмы — братьями Тимофеем и Николаем Богдановыми, вместе с ними работали устюжанин М. И. Шурухин и москвичи С. С. Соколов и Н. Евстратьев. Участие в работе над иконостасом братьев Богдановых объясняет его столь ярко выраженный барочный характер: на 1770—1780-е годы приходится расцвет барокко в Тотьме. Напомним, что Великий Устюг именно в это время вовлекается в сферу художественной жизни Петербурга и ряд его памятников отмечен уже чертами нового стиля — классицизма. Золотил царские врата и, вероятно, возглавлял работы по золочению самого иконостаса Петр Лабзин. Расписывал фигуры ангелов и «крыласы» устюжанин Прокопий Андреев, фигуры евангелистов – устюжанин Семен Попов. К сожалению, имена создателей самих фигур евангелистов и ангелов неизвестны. Иконы нижнего яруса (на обороте их есть авторская подпись: «писал иконописец Алексей Колмогоров 1776 г.») и ряд верхних в 1776—1781 годах писал известный художник Алексей Колмогоров. В 1781 году после его смерти десять апостольских икон и ряд других написали Егор Шергин и Василий Афанасьевич Аленев, священник городского Успенского собора. Вот что пишет об иконостасе С. Васильев: «Церковь во имя Троицы по отделке иконостаса может быть причислена к лучшим по епархии, а из монастырских в здешней губернии ее можно почитать первою после церкви, построенной баронами Строгановыми в Соль – Вычегодске. Резной. По полименту вызолоченный иконостас, в царских дверях евангелисты, а над ними серафимы и по сторонам ангелы, вырезанные из дерева – можно почитать мастерским произведением в художественном отношении. Живопись итальянской школы, исполненная здешними иконописцами, делает честь устюжским художникам и особенно протоиерею Оленеву». В 1973 году под руководством Ю. А. Рузавина (Всесоюзный научно-исследовательский институт реставрации) реставрируется иконостас Троицкого собора.